Определение болезней и повреждений картофеля по внешним признакам

  Определение болезней и повреждений картофеля основано на сопоставлении наиболее заметных признаков на имеющемся пораженном растительном материале с описаниями симптомов, приведенных в определителе. Признаки болезней и повреждений разделены по типам поражения и поражаемым органам растений. Если признаки определяемого поражения не совпадают с содержа­нием пункта, следует перейти к пункту, указанному в скобках. При совпадении признаков переходят к следующему по порядку пун­кту, доходя до пунктов с названиями болезней или повреждений. Прочитав все описания поражений до следующего пункта со скоб­ками, надо решить, признаки какого из них наиболее полно совпа­дают с признаками определяемого поражения. В том случае, если имеется растение с двумя или более типами поражений (например, некрозы и деформации), то определение следует вести по наибо­лее характерному признаку, и если после этого остались сомнения в правильности определения, то определить еще раз по другому признаку. Результаты обоих определений должны совпасть.

  При определении могут встретиться трудности, обусловлен­ные сходством признаков некоторых инфекционных болезней и непаразитарных повреждений, в частности - от недостатка или избытка в почве некоторых питательных элементов. В этих слу­чаях важно знать, как именно расположены пораженные расте­ния в поле. Если они разбросаны беспорядочно, более или менее равномерно по всему полю, наиболее вероятно, что речь идет об инфекционных болезнях. Размещение пораженных растений куртинами, пятнами и полосами в зависимости от микрорельефа поля, обработки почвы или внесения удобрений говорит в пользу непаразитарного характера поражения. Иногда бывает необхо­дим простейший анализ сока растений на содержание важнейших элементов. В случае затруднения с диагностикой болезней карто­феля по внешним признакам следует провести дополнительную идентификацию возбудителей инструментальными методами (например, с помощью микроскопа).

Методы молекулярной диагностики болезней картофеля

  Еще два десятилетия назад методы диагностики инфекций у растений были довольно трудоемкими и занимали много вре­мени. Использование растений-индикаторов для идентификации вирусов, специальных сред для выявления бактерий и другие традиционные методы анализа занимали дни, а, в ряде случаев, недели и месяцы.

  Основной прорыв произощел с внедрением в диагностику метода иммуно-ферментного анализа (ИФА), одним из наиболее распространенных вариантов которого является так называемый ELISA-тест (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). Ме­тод позволил не только увеличить чувствительность анализа, но и сократить время тестирования до нескольких часов. ELISA и по сей день является наиболее распространенным и широко используемым методом анализа растительного материала для диагностики и идентификации патогенов. При постановке ИФА тестов используется целый ряд технологий и модификаций с ис­пользованием биотиниликованных и конъюгированных с щелоч­ной фосфатазой или пирофосфотазой антител в так называемых прямом методе, двойном и тройном сандвичах и др.

  Диагностика фитопатогенов методом ИФА хорошо зарекомендо­вала себя в широкомасштабных рутинных тестированиях раститель­ного материала, однако метод обладает не всегда удовлетворительной специфичностью, диагностируя зачастую не отдельные патогены, а целые группы и не позволяет четко идентифицировать конкретные изоляты и штаммы. Следует иметь в виду и тот факт, что от партии к партии качество и специфичность получаемых антител может до­вольно существенно разниться. В настоящее время специфичность ИФА в значительной степени увеличена за счет использования моно-клональных и рекомбинантных антител. Использование модифика­ции метода ИФА - процедуры иммуноферментного анализа отпечат­ков образцов растительных тканей на нитроцелдюлозной мембране (tissue print-ELISA) - также обеспечивает высокую специфичность, хотя чувствительность этого метода недостаточна для использования в случае детекции ряда латентных бактериальных инфекций.

Дрзтим серологическим методом, применяемым для диа­гностики фитопатогенов, в частности бактерий, является метод проточной фотометрии (Alvarez, 2001), хотя высокая стоимость используемой в этой процедуре аппаратуры существенно ограни­чивает его использование в реальной практике.

В настоящее время при анализе растительного материала возникает необходимость применения высокочувствительных и специфичных методов детекции, позволяющих диагностиро­вать патогены в низкой концентрации, что особенно важно в слу­чае контроля растительного материала на наличие карантинных патогенов. Поэтому в помощь, а сегодня все чаще на смену тра­диционным и серологическим методам, в практику контроля фи-тосанитарного состояния сельскохозяйственных растений и про­дуктов их переработки приходят молекулярные технологии. Это позволяет значительно повышать специфичность анализов и обеспечивать чувствительность, в 10 - 100 раз превышающую чувствительность ИФА.

  Современный метод высокоэффективного тестирования па­тогенов, в том числе и фитопатогенов, основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Bartlett, Stirling, 2003). Простота, высокие чувствительность и специфичность, хорошая воспроизводимость результатов анализов быстро превратили этот подход в один из наиболее перспективных диагностических методов. В отли­чие от традиционных и серологических методов анализа, даю­щих только опосредованное свидетельство наличия инфекции (например, сведения о наличие белков-антигенов диагностируе­мых патогенов), метод ПЦР напрямую доказывает присутствие возбудителя инфекции, специфически выявляя наличие конкрет­ной последовательности нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) обнаруживаемого патогена. Кроме того, метод ПЦР, благодаря своей высокой чувствительности, позволяет выявлять единичные копии геномов патогенов, обнаруживая тем самым их наличие тогда, когда другими методами (иммунологическими, бактерио­логическими, микроскопическими) это сделать практически не­возможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто сущест­вующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях: ПЦР-технологии, как правило, позволяют избежать сложностей, свя­занных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Кроме того, использование метода ПЦР позволяет зна­чительно сократить время анализа образца. За счет автоматиза­ции процесс амплификации занимает всего 1 - 2 часа, а с учетом предшествующей пробоподготовки и регистрации результатов анализа, весь процесс занимает не более 4 часов. Помимо всего выше перечисленного, существенным достоинством метода яв­ляется возможность осуществлять количественное определение возбудителя в модификации метода ПЦР в реальном времени.

Высокая чувствительность ПЦР является как преимуществом, так и недостатком метода, создавая ряд проблем, одной из кото­рых является высокая вероятность появления ложноположитель-ных и ложноотрицательных данных. Кроме того, корректность проводимых ПЦР-тестов в значительной степени зависит от адек­ватности методов выделения нуклеиновых кислот из раститель­ного материала; чувствительность детекции зависит от влияния присутствующих в растительном материале ингибиторов ПЦР.

  Все это усложняет процедуру ПЦР-детекции, требуя постановки дополнительных контрольных тестов или использования моди­фикаций метода ПЦР. При молекулярной диагностике фитопато-генных грибов, вирусов и бактерий применяют следующие моди­фикации ПЦР: метод конкурентной ПЦР (Mauchline et al., 2002), кооперативной ПЦР (Co-PCR) (Olmos et al., 2002), ПЦР-гибри-дизация in situ с использованием флуоресцентных зондов (Lopez et al., 2003), мультиплексная ПЦР (Rigotti, Gugerli, 2007), метод множественной (или групповой) мультиплексной ПЦР (multiplex nested RT-PCR) (Morris et al., 2001, Ciapina et al., 2004), метод ПЦР в реальном времени (real-time PCR) (Norman et al, 2002).

  Наиболее перспективным для диагностических лабораторий, проводящих рутинные анализы, являются методы ПЦР в форма­те FLASH (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization) (Лаптинов, 2004) или в формате реального времени (Norman et al., 2002). Оба формата основаны на флуоресцентной детекции про­дуктов амплификации. Оба формата позволяют регистрировать результаты ПЦР непосредственно во время (ПЦР в формате ре­ального времени) или после проведения реакции (ПЦР в форма­те FLASH), без открывания пробирок, благодаря чему решается проблема контаминации помещения продуктами ПЩ', упроща­ются требования к организации ПЦР-лаборатории, значительно снижается трудоемкость и время проведения стадии детекции. Методы обеспечивают также возможность простой и эффектив­ной документации и хранения результатов ПЦР в компьютерной базе данньгх. Следует отметить, что ПЦР в формате реального времени требует довольно дорогого оборудования, тогда как сто­имость оборудования для ПЦР в формате FLASH сопоставима с оборудованием для гель-электрофореза и в 5 - 8 раз дешевле оборудования для ПЦР в реальном времени.

  Другим примером применения молекулярных методов для диагностики фитопатогенов, основанных на ПЦР и включающих гибридизацию, является весьма перспективный, но пока только развивающийся метод биочипов (Schultz, 1996). Преимущества ис­пользования биочипов состоят в следующем: биочип дает возмож­ность проведения множественного параллельного исследования биологических объектов (тысячи ячеек на 1 см²); он миниатюрен, что обеспечивает удобство эксплуатации, экономию реактивов и т д.; биочип универсален и дешев, так как одна технологическая схема обеспечивает производство различных микрочипов; в био­чипе можно использовать в качестве иммобилизованных зондов

фрагменты ДНК, РНК, белков (с сохранением ферментативных и антигенных свойств), а также клеток - биосенсоров.

  Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что современ­ные, доступные для широкого круга потенциальных потребите­лей технологии диагностики и идентификации фитопатогенов базируются, в основном, на двух технологиях - ИФА и ПЦР, ко­торые постоянно совершенствуются в плане чувствительности, надежности и простоты применения. Кроме того, в настоящее время существует тенденция использования комплекса методов (ring tests), включающих как традиционные (микроскопия, изби­рательные среды, патогенность и т.п.), так и современные серо­логические и молекулярные тесты. Диагностика фитопатогенов, как собственно и любых других объектов, приобретает черты ди­намичной и постоянно эволюционирующей системы.

Диагностические системы

   Современные диагностические системы должны характеризо­ваться следующими качествами: более высокой чувствительнос­тью и, главным образом, специфичностью, а также максимальной автоматизацией и, как следствие, стандартизацией большинства этапов анализа. Не менее важно добиваться уменьшения веро­ятности субъективной оценки результатов и снижения роли че­ловеческого фактора, повышать производительность системы при низкой себестоимости выполнения анализа, сокращать об­щее количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа и компьютеризировать ввод и обработку результатов анализов совместимым программным обеспечением.
  В современной отечественной практике в области сельско­хозяйственного растениеводства, в основном, применяются диагностические системы, не отвечающие вышеизложенным требованиям и основанные на простых иммуноферментных методах анализа. В определенной степени это могло бы быть обусловлено тем, что развитие ПЦР-методов анализа вирусных, грибных, бактериальных и нематодных поражений лимитиру­ется отставанием по секвенированию их геномов. К примеру, из 222 бактериальных геномов, работа над секвенированием ко­торых велась или была закончена к 2003 году, фитопатогенами были менее 14 (Lopez et al., 2003). С другой стороны, в реальном секторе практически полностью отсутствуют лаборатории, ос­нащенные современным оборудованием и квалифицированны­ми кадрами. Исключение составляют лишь некоторые подраз­деления службы карантина растений.
  Говоря о положении в диагностике вирусных фитопатоге­нов картофеля в сегодняшней России в целом, можно упомянуть лишь несколько разработок. Еще в начале 80-х годов прошлого века, в СССР были разработаны ИФА-тесты основных вирусных патогенов картофеля, которые до сих пор производятся на базе ВНИИКХ (Атабеков И. Г., Тальянский, 1997). Довольно качес­твенные моноклональные антитела к ряду вирусов картофеля были получены в ИБХ РАН, однако эти работы не завершились созданием законченных тест-систем.
  Современные методы диагностики вирусных патогенов кар­тофеля, основанные на методе ПЦР, разработаны в конце про­шлого и в начале нынешнего века во многих лабораториях мира, в том числе и в России. Здесь, в частности, хотелось бы отметить разработку системы универсальной ПЦР-диагностики вирусов растений, основанной на их групповой принадлежности (Маагоп, Zavriev, 2002). В настоящее время на нашем рынке наиболее ши­рокий ассортимент диагностических наборов для определения фитопатогенов предлагает ООО «АгроДиагностика». Для диа­гностики вирусных патогенов картофеля этой фирмой освоено производство ПЦР тест-систем в формате электрофореза, FLASH-ПЦР и ПЦР в реальном времени. В настоящее время освоен вы­пуск наборов для диагностики вируса скручивания листьев кар­тофеля, М, S, X, Y и А вирусов картофеля, вируса метельчатости верхушек картофеля и вироида веретеновидности клубней карто­феля.
  К сожалению, в России сегодня использование и внедрение этих разработок даже при тестировании посадочного материала широкого применения пока не нашло. Исключением являются частные компании, в первую очередь производители посадочно­го материала мини-клубней картофеля, например, фирма «Дока», Зеленоград. Как правило, они используют тест-системы запад­ных компаний, в первую очередь фирмы «Agdia» (США) (см. www.agdia.com). Так, «Agdia» предлагает ELISA-тесты к 16 ви­русным патогенам картофеля. Важно отметить, что часть на­иболее экономически значимых тестов предлагается в варианте т. н. стрипов (Рис. XXXIX), где анализ хоть и довольно дорогой (около 10 долларов США за один тест), но настолько прост, что не требует специальной квалификации персонала, занимает око­ло 20 минут и может производиться в полевых условиях. Сре­ди европейских фирм на рынке анализа фитопатогенов следует отметить также фирмы «Adgen» (Великобритания), и «Agritest» (Италия), «Ingenasa», «Plant-Print Diagnostics)) и «Durviz)) (Испа­ния), и «Леве)) (Германия), спектр услуг которых по некоторым патогенам дополняет продукцию «Agdia)>.
  Следует упомянуть и весьма эффективные гибридизационные методы. С помощью этих методов можно не только диагностиро­вать тот или иной патоген, но и получить при необходимости ко­личественную информацию относительно копий анализируемого гена или фитопатогена. В России на основе гибридизационного метода в МГУ им. М. В. Ломоносова была разработана система идентификации вироида веретеновидности клубней картофеля (Атабеков И.Г., Тальянский, 1997). Важно отметить, что в сис­теме использовался не радиоактивный, а флуоресцентный зонд, что делает этот метод безопасным. Похожие методы диагностики вироида веретеновидности клубней картофеля и других вирои-дов, основанные на радиоактивно-меченных и флуоресцентных зондах, используются в рутинных анализах и за рубежом.
  При диагностике бактериальных инфекций основными оста­ются ИФА-методы. Необходимо отметить, что чувствительность ИФА-методов диагностики бактериальных фитопатогенов даже с использованием моноклональных антител не всегда достаточ­но высока, особенно в случае латентной инфекции. Это обстоя­тельство требует предварительного увеличения количества бак­терий в образце путем их специфической репродукции (Caruso et al, 2002). В каждом конкретном случае необходим подбор оп­тимальных условий репродукции (среды, температура, условия инкубации образцов и т.п.). Во многих случаях существует необ­ходимость тестирования большого числа образцов малоквалифи­цированным персоналом, для чего предложены простые коммер­ческие методы, использующие процедуру иммуноферментного анализа отпечатков образцов растительных тканей на нитроцел­дюлозной мембране (tissue print-ELISA). Специфичность этого метода достаточно высока, однако чувствительность, как пра­вило, недостаточна для достоверной диагностики ряда бактери­альных инфекций. Некоторые специфические задачи решаются с использованием метода проточной фотометрии (Alvarez, 2001). Бактериальные клетки при этом идентифицируются с помощью конъюгатов специфических антител с флуоресцентным красите­лем. Исследование растительных экстрактов этим методом поз­воляет отделять неинфицированные образцы от инфицированных на ранних этапах развития бактериальной инфекции. Существен­ным ограничением использования данного метода в настоящее время является высокая стоимость применяемой аппаратуры.
  На мировом рынке имеются коммерческие диагностические наборы на фитопатогены картофеля, основанные на методе ИФА. Например, фирма «Agdia» предлагает ELISA-тесты к трем пато­генам картофеля бактериального происхождения.
  При диагностировании бактериальных фитопатогенов ме­тодом ПЦР во многих случаях необходимости в их размноже­нии нет. Когда она необходима, следует оптимизировать как этот процесс, так и условия ПЦР-амплификации (Penyalver et al, 2000). Чувствительность диагностики бактериальных фитопато­генов может быть увеличена также путем использования особого варианта ПЦР - т. н. «кооперативной ПЦР» (Olmos et al., 2002). Этот метод был успещно применен для обнаружения возбуди­теля бурой гнили картофеля - бактерии Ralstonia solanacearum в образцах воды. В самое последнее время с целью обнаружения единичных бактериальных клеток в образцах растительных тка­ней используется метод гибридизации in situ с использованием флуоресцентных ДНК-зондов, узнающих видоспецифические участки бактериальных геномов (Volkhard et al., 2000). В России рынок диагностики бактериальных инфекций картофеля методом ПНР представлен наборами, предлагаемыми ООО «АгроДиагнос­тика» для возбудителей кольцевой гнили картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) и бурой бактериальной гнили картофеля {Ralstonia solanacearum).
  Немаловажными патогенами картофеля являются нематоды, которые поражают практически все виды растений, включая кар­тофель. В связи с тем, что заболевания, вызванные нематодами приводят к очень большим потерям урожаев, мониторинг фитопа-тогенных нематод весьма важен и актуален. В Европе и в России цистообразующие нематоды, поражающие картофель - Globodera rostochiensis и Globodera pallida - имеют статус карантинных па­тогенов.
  В настоящее время обнаружение и идентификация нематод осуществляется как с помощью классических, в первую оче­редь, морфологических, так и современных методов, основанных на ПЦР технологиях (Ibrahim et al., 2001). Наиболее четко и точно видовую идентификацию нематод в современных лабораториях проводят с помощью ПЦР (подробные методические описания можно найти на сайте www.nematode.unl.Edu/nemaid). На рос­сийском рынке на обе вышеупомянутые нематоды имеются ПЦР-диагностические наборы фирмы ООО «АгроДиагностика».
  Другой группой патогенов картофеля, наносящих этой культуре немалый вред, являются инфекции грибной природы. В последние годы наблюдается заметная тенденция и прогресс в использовании молекулярных методов диагностики не только отдельных фитопатогенных грибов, но и в микологии в целом (Atkins, Clark, 2004). Однако, по состоянию на сегодняшний день, диагностических систем для рутинной диагностики фитопатоген­ных грибов, в том числе и карантинных, с использованием ДНК технологий в России не производится. На рынке имеются осно­ванные на ИФА тест-системы фирмы «Agdia» к двум грибным патогенам картофеля.
  Таким образом, на сегодняшний день ситуацию по рынку диагностики фитопатогенов картофеля можно суммировать следующим образом. В мировой практике диагностика фито­патогенов широко применяются в сельскохозяйственном рас­тениеводстве. При этом имеется целый ряд фирм, в том числе и в России, предлагающих коммерческие диагностические на­боры, подавляющее большинство которых основано на различ­ных модификациях метода ИФА, уступающих по своей чувс­твительности и специфичности методам, основанным на ПЦР. В России рынок ПЦР-диагностики фитопатогенов, в том числе и патогенов картофеля, только создается и пока представлен ООО «АгроДиагностика». С сожалением следует констатиро­вать, что в России использование и широкое внедрение этих разработок в практику сельскохозяйственного производства пока не применяется даже при тестировании посадочного мате­риала, разве что в отдельных частных компаниях, занимающих­ся производством посадочного материала картофеля.